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单纯性疱疹实验室诊断
概述
单纯疱疹病毒HSV是人类最常见的病原体，人是其唯一的自然宿主。HSV主要有两个血清型：HSV-1和HSV-2。HSV-1主要侵犯躯体腰以上部位，典型症状为口腔疱疹；HSV-2侵及躯体腰以下部位，主要症状是生殖器，它是引起性病的主要病原体之一。健康人通过与患者直接密切接触和性接触而被感染。活动感染期的孕妇可通过产道传染胎儿。病毒感染后以隐性感染为常见，仅有10％-20％的初次感染者出现症状。
HSV隐性感染的特点，是其得以广泛传播的重要原因之一。又由于HSV常与其它病原体如：梅毒、念珠菌、疥疮等引起的疾病有相同的临床症状，而先天性单纯疱疹病毒感染与先天性弓形虫、风疹、巨细胞病毒感染的临床表现都很类似。所以，单纯疱疹病毒的确定性诊断对于疾病的控制和管理；选择适合的治疗方案以及说服病人配合方面都是非常重要的。临床实验室的抗原和血清学抗体检测是有效的确诊方法。
HSV感染与HIV一样为终生携带。临床实验室习惯于用HSV IgM抗体检测单疱感染，但IgM抗体仅对原发感染具有诊断价值。对于复发感染，由于IgM抗体很少出现而无法有效诊断。单疱抗原诊断可以诊断所有有症状的HSV感染，但是抗原检测无法区分是否原发感染。
由于1型单疱和2型单疱有50％的同源序列，因此临床诊断上两者非常容易交叉。区别诊断的简便方法目前只有两种：如果是隐性感染可以使用血清学特异性IgG抗体，如果为有症状感染可以使用DFA方法分型。
HSV流行病学
人群中HSV感染普遍，发展中国家成人抗HSV抗体阳性率为95-100％，其中原发性感染中80－90％为隐性感染。新生儿HSV感染发病率为0.05-1/万例，其中绝大多数为母亲生殖道HSV上行播散或分娩时经产道感染所致。
由于对HSV无免疫，故成人感染增加。HSV-2是生殖器疱疹的主要病原体，90%生殖器疱疹病例是由HSV-2型引起，10%由HSV-1型引起。近年来由于性方式的多样化，HSV-1引起的生殖器疱疹有上升的趋势。生殖器疱疹已成为欧美最常见的性病之一。现在全球的感染率超过1亿。如英国自1971年的4000例增至1985年的20000例。美国大于19岁的青少年中，有1/5的男性和1/4的女性感染HSV，自1970年以来HSV2感染上升了30％，12-19岁青少年HSV2感染率增加了5倍，20-29岁成人HSV2感染则增加了2倍。美国现累计病例已超过6000万。在发展中国家，HSV-2血清流行率更高，如乌干达妇女保健诊所高达41%，秘鲁STD中心为83%。目前估计我国HSV感染的确切流行情况是困难的，但可以肯定的是我国近几年生殖器疱疹也明显增加。1991年我国16个大中城市性病检测仅报告156例HSV感染，而2001年仅广东省就报告了HSV 5499例，占性病中的5.86%。
HSV传播途径
·HSV1主要通过密切接触传播，通常是亲吻。儿童容易感染。90％的成人已有HSV1抗体。
·HSV2主要通过性接触和母婴传播。据调查，HSV2抗体通常在青春期有了性行为之后才出现。生殖器疱疹患者及HSV2携带者具有很高的传染性，与之发生性关系后，50~80%会被感染。一般20-30%的成人有抗HSV2抗体。母婴垂直感染的几率为4～5％。
由于性交方式的多样化发展，1型和2型HSV也可能发生交叉感染。
新生儿感染：主要通过宫内、产道以及产后接触感染,其中产道感染占75％。新生儿感染中80％由HSV-2引起，20％由HSV-1引起。
HSV危害
1、HSV1的影响
·口腔疱疹反复发作，影响生活质量
·隐性感染容易扩散
·孕产妇感染容易传染给新生儿，导致严重后果
·长期感染可能导致HSV性脑炎
2、HSV2的危害
·隐性感染容易扩散
·生殖器感染，影响心理、情绪和生活质量
·孕妇感染可能出现流产、死胎死产、胎儿发育迟缓、胎儿畸形、早产等一系列严重后果
·新生儿感染可能出现呼吸衰竭等严重症状、甚至死亡
·与HPV协同作用导致宫颈癌
·与HIV-1感染相互促进，增加感染其它性传播疾病的风险
HSV免疫学
HSV病毒感染经过4～14天的潜伏期开始出现疱疹症状，这一时期病毒快速复制。疱疹经过5～6天逐渐扩展成溃疡，这一时期病毒水平先升后降、总体保持平衡。溃疡经过5～25天慢慢愈合，这一时期病毒水平急速下降，溃疡完全愈合时基本检测不到抗原。
IgM抗体在感染后2～3天出现，7天左右达到最大值，此后维持一段时间的平衡。在愈合期IgM抗体水平快速下降，8周左右基本检测不到抗体。潜伏感染、无症状感染和复发感染时基本检测不到IgM抗体。
IgG抗体在感染后7天左右出现，2周左右达到最大值，此后缓慢下降，至愈合期基本维持平衡。一旦病毒再次复发，IgG抗体水平再次快速升高并于1周内达到高峰，此后快速恢复到正常值。
图1：HSV感染的免疫学特征
抗原
抗原
IgG抗体
IgM抗体
滴度
时间（周）
HSV实验室诊断
1、病毒分离
由于需要疱疹泡液患处分泌物作为标本，所以，病毒分离培养方法只在疱疹期(约1-2周)适用此方法。且随着疱疹的发展，若发疹时病毒分离率为97％，则脓泡期降为87％，到溃疡期则有70％，结痂时病毒的分离率只有27％。所以疱疹后期容易出现假阴性结果。
从水疱底部取材接种易感细胞中培养1～2天，出现细胞肿胀，变圆，相互融合等病变，可作初步诊断。然后用免疫荧光法（IFA），或酶联免疫吸附试验（ELISA）进行鉴定，确诊HSV。必要时进行分型。
整个过程需5-10天，而且技术条件要求高，价格昂贵，不能普遍使用。
2、抗原检测
与病毒分离一样，由于抗原检测需要的也是水疱标本，所以也只能在疱疹期适用。常用的抗原检测方法有DFA、IFA、ELISA等。
ELISA使用泡液或患处分泌物标本，检测前需要进行处理。且整个ELISA试验过程需要2小时以上。ELISA适用于大批量标本的检测，如标本量较少，则成本相应增加。
DFA法可以直接使用患处基部分泌物标本，检测前不需要特殊处理。使用该法一般30分钟内可以得出检测结果，所以尤其适用于标本量较少的实验室和医疗机构。而研究表明DFA与病毒分离培养方法结合，其灵敏度可以提高10-15％。DFA直接标本抗原检测与ELISA抗原检测的灵敏度相当，并且具有可以分型诊断的优势。
上述两种方法准确性是比较可靠的，但仍然存在以下问题：
伤口治愈或消失后检测不到病毒感染，可以使用的期间较短，即只有在疱疹前期才可以进行抗原检测，伤口溃疡后期或愈合后，抗原检测方法容易造成假阴性结果。
HSV在实验室的培养很少成功，或者用于抗原检测的标本量不足。
从另一方面来说，由于HSV2引起的疱疹典型，大多数情况下不需要实验室诊断即可确认。
所以国外进行HSV2检测使用抗原检测法较少。
3、DNA检测
HSV的中枢神经系统感染单独出现时诊断比较困难。一般对脑组织进行病毒分离或检测特异性抗原、脑脊液分离病毒或检测特异性抗原虽可确诊，但阳性率太低，可能是由于病毒量太少。现报告PCR可以进一步提高灵敏度，是以后诊断HSV中枢神经系统感染的趋势。
毫无疑问，PCR是最敏感的一种检测方法。但也是由于其高灵敏度，容易造成假阳性结果。从实验要求来看，PCR成本、技术、实验室要求等都很高。我国现已对PCR实验室实行规范化管理，要建立一个规范的PCR实验室对于大多数医疗机构和实验室来说在现阶段来说是不可能的。而在国外，PCR也只限于在一些条件较好的实验室使用。
另外隐性感染或带毒期病毒隐藏在神经节时，PCR检测对于一般的标本也无能为力。
4、血清学检查
血清学检测疱疹病毒感染是一种非常吸引的方法：
对培养法阴性标本进行确认
诊断隐性病人
性伴侣为疱疹感染的人群筛查
孕妇和新生儿筛查
用血清学诊断单纯疱疹病毒感染是非常快的，因为一旦一个人被感染，其体内免疫物质出现免疫应答，进而出现抗体。单纯疱疹抗体在首次感染4天即可出现，IgG抗体则在2个星期后出现高滴度。IgM则更早出现。
血清学检测方法有韦斯顿印迹法（WB）、补体结合试验方法，ELISA方法。
血清学IgM抗体还具有可以区分原发感染和先天性疱疹感染的优势，其局限性在于不能分型、不能诊断复发感染。血清学特异性IgG抗体具有可以诊断隐性感染和可以分型的优势，其局限性在于判断是否活动性感染需要两次采样和定量检测。
先天性单纯疱疹病毒感染诊断
由于临床表现与其他TORCH病毒感染引起的临床表现相似，所以主要依靠病毒学和血清学检查。如新生儿病毒分离阳性或血中抗HSV IgM 抗体阳性即可确诊。直接荧光抗体法检测病毒抗原亦可迅速诊断。
新生儿单纯疱疹病毒感染诊断
如果母亲产道有疱疹或单纯疱疹病毒阳性者较易诊断。发病后皮肤、粘膜伴有典型疱疹病变者诊断也不太困难。但确诊还是必须依据病毒学和血清学证明。如果病毒分离阳性或/和新生儿血清中出现特异性IgM抗体，或一般抗HSV抗体在病程中有4倍以上的升高均可协助诊断。
HSV感染
80～90％ 10～20％
隐性感染 有症状感染
（平均5～7天）
潜伏期 1～26天
抗原检测/病毒分离
IgM抗体检测
疱 疹
PCR检测
疱疹期
5～6天
溃 疡
愈合期
1～2周
愈 合
带毒期
病毒在患处
和神经节潜伏
血清学特异性IgG抗体检测
病毒再激活
PCR检测
抗原检测/病毒分离
复发感染
平均每年4次以上
疱 疹
愈 合
复 发
图2：HSV分期实验室诊断
比较项目/
检测方法
培养分离 抗原 PCR 血清学抗体检测
DFA/IFA ELISA ELISA WB
适用对象 原发感染
有症状病人，有明显
疱疹出现
原发感染
有症状病人，有明显
疱疹出现
疑为脑炎或先天性疱疹病毒感染患者、有神经系统并发症 培养或其它方法阴性确认
隐性病人(IgG)
伴侣确诊为HSV感染者筛查
孕妇筛查
灵敏度 较低 较高 高 非常高 高 非常高
特异性 较高 一般 较高 高 高 非常高
标本要求 最高
泡液或溃疡期分泌物
一般
疱疹基部分泌物
一般
泡液或溃疡期分泌物
较低
脑脊液
羊水及婴儿血清
脑组织
患处分泌物
低
血清
低
血清
试验时间 5－10天 <30分钟 1－3小时 <30分钟 1－2小时 1－2小时
操作难易 非常难 简单 简单 难 简单 难
成本 高 一般 较低 非常高 较低 高
表1：HSV实验室诊断方法比较
无症状患者
血清特异性IgG抗体检测
HSV1阳性 HSV2阳性 全阳性 全阴性
7～14天后重新取样，与原样本平行检测
抗体滴度维持平衡 抗体滴度显著上升/下降
过往HSV1/HSV2感染 近期HSV1/HSV2感染 HSV阴性
图3：HSV隐性感染的诊断方案
临床有疑似症状患者
DFA检测
HSV1阳性 HSV2阳性 全阳性 阴性
IFA或PCR确认 特异型IgG抗体检测
HSV1阳性 HSV2阳性 全阳性 阴性 阳性
7～14天后重新取样，与原样本平行检测
抗体滴度维持平衡 抗体滴度显著上升/下降
近期HSV1/HSV2感染 HSV阴性 过往感染 近期感染
图4：有症状HSV患者的诊断方案
广州康润生物HSV诊断产品介绍
1、HSV IgM酶免试剂盒
广州康润生物提供HSV1型和2型IgM试剂盒各三种，分别为双板间接法、重组间接法和捕获法。它们之间的比较见表2：
方法\项目 操作繁琐度 成本 实验时间 敏感度％ 特异性％
双板间接法 样本需要稀释，吸附，
每个样本同时检测2孔
￥27/人份 60min ＞96 ～100
重组间接法 样本需要稀释 ￥20/人份 60min ＞98 ＞97
捕获法 无需样本处理 ￥18/人份 140min ＞92 ～100
表2：三种HSV IgM试剂的比较
双板间接法试剂由于采用了样本吸附和校正板复孔检测的方法去除杂质干扰，因而特异性非常高。同时由于样本前处理步骤比较多，操作也最繁琐。容易出现人为操作误差。重组间接法试剂由于采用了纯化抗原，因此免除了繁琐的样本处理过程同样达到理想的效果。捕获法操作最简单，但是敏感度相对不高。
2、HSV特异性IgG抗体试剂盒
目前市场上检测HSV2和HSV1 IgG抗体的试剂很多，但通常为非特异性的，容易与HSV1或其它抗体发生交叉反应。有的在检测只含有HSV1的标本中显示HSV2阳性；有的在HSV1存在的情况下，不可以检测出HSV-2。由于HSV1和HSV2的危害性和治疗、预后差别很大，区别诊断显得非常重要。
Ashley等人的研究比较了3种HSV检测试剂盒，发现其准确率低于一半。而Martins等人的研究则以WB为金标准，用了另外3种试剂进行对比，发现在低感染率人群，能够准确进行特异性分型的比率难以让人接受。美国CDC指出限制使用非特异性的HSVIgG检测试剂。Martins的研究结果如下：
公司 交叉反应 灵敏度 特异性
HSV1(%) HSV2(%) HSV1(%) HSV2(%)
Diamedix
Zenus
Wampole
82%
54%
47%
100
92
98
100
98
95
77
72
68
61
79
85
表3：美国临床病理学杂志报道的HSV试剂盒的准确性数据
广州康润公司代理的Tinity公司的HSV1和HSV2特异性IgG抗体试剂是少数几个通过了美国FDA认证的HSV型特异性IgG试剂盒之一。其与WB法特异性试剂盒相比敏感度达到94%，特异性超过98%，总符合率为95.5%。
3、HSV DFA试剂盒
我公司提供的DFA试剂盒可以分型诊断，15分钟出结果，敏感度与ELISA抗原试剂盒相当，特异性接近100%。具体见表4：
项目\方法 ELISA抗原 DFA IgM ELISA
适用范围 疱疹期 疱疹期 首次感染疱疹期
实验时间 2小时 15分钟 1.5小时
敏感度 87％～95％ 88％～96％ 93～97％
特异性 ＞95％ ～100％ ＞97％
成本 ￥23～32/人份 ￥40/人份 16～30/人份
表4：HSV临床诊断3中常用方法的比较。
表4中成本项，是考虑一次性做完整个试剂盒的情况。实际上单疱的诊断通常每次样本不超过10份。此时用ELISA方法诊断，由于每次都必须运行质控，成本可高达￥40～60/人份。而这一情况对DFA实验成本没有影响。
4、康润公司HSV诊断系列产品（表）
编号 试剂名称 规格 报价 产地 备注
KIT25450 HSV1 IgM酶免试剂盒（双板间接法） 96T 2300 美国 FDA/CE
KIT25460 HSV1 IgM酶免试剂盒（重组间接法） 96T 1800 美国 FDA/CE
KIT25800 HSV1 特异性IgG酶免试剂盒 96T 2300 美国 FDA/CE
KIT25550 HSV2 IgM酶免试剂盒（双板间接法） 96T 2300 美国 FDA/CE
KIT25560 HSV2 IgM酶免试剂盒（重组间接法） 96T 1800 美国 FDA/CE
KIT25900 HSV2 特异性IgG酶免试剂盒 96T 2300 美国 FDA/CE
KITHSM-1 HSV1+2 IgM酶免试剂盒（捕获法） 96T 1800 爱尔兰 CE
KITHSG-1 HSV1+2 IgG酶免试剂盒（捕获法） 96T 1600 爱尔兰 CE
KIT349UL HSV1&2 DFA 确认/分型试剂盒 60T 2400 爱尔兰 FDA/CE
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